Un trois

npj Biofilms et Microbiomes volume 9, Numéro d'article : 57 (2023) Citer cet article

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La pléthore de facteurs de stress susceptibles d’endommager les cellules microbiennes a donné naissance à des mécanismes sophistiqués de réponse au stress. Alors que les bioreporters existants peuvent surveiller les réponses individuelles, les capteurs permettant de détecter les réponses multimodales au stress chez les micro-organismes vivants font encore défaut. Les protéines fluorescentes rouges, vertes et bleues détectables orthogonalement, combinées dans un seul plasmide, appelé rapporteur RGB-S, permettent une analyse simultanée, indépendante et en temps réel de la réponse transcriptionnelle d'Escherichia coli à l'aide de trois promoteurs qui rapportent le stress physiologique (PosmY pour RpoS). ), la génotoxicité (PsulA pour SOS) et la cytotoxicité (PgrpE pour RpoH). Le bioreporter est compatible avec l’analyse standard et le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) combiné à une analyse ultérieure du transcriptome. Divers facteurs de stress, y compris le 2-propanol biotechnologiquement pertinent, activent une, deux ou les trois réponses au stress, ce qui peut avoir un impact significatif sur les voies métaboliques non liées au stress. Mis en œuvre en culture microfluidique avec imagerie par microscopie confocale à fluorescence, le rapporteur RGB-S a permis une analyse spatio-temporelle de biofilms vivants révélant des sous-populations stratifiées de bactéries présentant des réponses au stress hétérogènes.

La compréhension de la manière dont les micro-organismes interviennent dans les changements adaptatifs pour assurer leur survie dans des conditions environnementales changeantes nécessite la surveillance des voies de réponse au stress correspondantes. RpoS, SOS et RpoH sont des voies critiques de réponse au stress qui modulent les voies transcriptionnelles à travers un large spectre de stimuli de stress, avec des implications pour la formation et la prolifération de biofilms1,2, la virulence des agents pathogènes3, la résistance aux antibiotiques4, l'évolution4 et la compétition écologique5. RpoS est un facteur sigma alternatif qui régule, directement et indirectement, environ 500 gènes chez Escherichia coli (E. coli)6. Connue sous le nom de réponse générale au stress, l’activation du RpoS est principalement stimulée par la famine en tant qu’indicateur du stress physiologique7. La réponse SOS, quant à elle, comprend plus de 50 gènes qui assurent plusieurs fonctions en réponse aux dommages à l'ADN induits par des agents chimiques, physiques ou biologiques8. Par conséquent, la régulation positive de la réponse SOS est associée à la génotoxicité cellulaire. Le facteur sigma alternatif RpoH est le régulateur clé de la réponse au stress lié au choc thermique chez E. coli qui englobe plus de 30 gènes9,10. L'activation de la réponse RpoH est stimulée par l'accumulation de protéines dépliées dans la cellule, indication de cytotoxicité.

Compte tenu de la grande importance de ces processus biologiques pour la technologie et la médecine, une compréhension globale des mécanismes moléculaires sous-jacents revêt une importance capitale. Par exemple, la surveillance des réponses cellulaires à plusieurs facteurs de stress peut apporter une contribution importante à la compréhension de la viabilité et de la productivité cellulaire11, comme l'inhibition des produits, la privation de nutriments, le pH ou le stress de cisaillement12, ainsi qu'à la surveillance d'une variété de substances toxiques pour l'environnement, comme les herbicides ou les antibiotiques13. Une analyse multimodale de la réponse microbienne au stress serait donc importante non seulement pour la recherche fondamentale mais également pour les processus biotechnologiques.

Dans ce but, plusieurs biocapteurs bactériens génétiquement codés ont été développés12,13,14,15,16,17,18. Les éléments rapporteurs couramment utilisés sont les rapporteurs colorimétriques β-galactosidase (lacZ)15 et bioluminescence (luc, lux)16. Étant donné que ces systèmes nécessitent généralement une lyse cellulaire, des analyses en plusieurs étapes ou des réactions catalytiques qui limitent les mesures en ligne et les rapports multicolores, des rapporteurs basés sur la fluorescence ont été développés pour l'analyse de la réponse au stress17,18. Cependant, les systèmes actuellement disponibles n’ont pas la capacité de rapporter la réponse multimodale des cellules vivantes avec une résolution spatio-temporelle élevée. Nous décrivons ici un biocapteur fluorescent tricolore génétiquement codé qui affiche simultanément la réponse bactérienne au stress physiologique, à la génotoxicité et à la cytotoxicité grâce à la surveillance des voies de réponse au stress correspondantes (Fig. 1 et Fig. 1 supplémentaire).